유전자 가위를 쓰는 다양한 방법들

[송기원의 포스트 게놈 시대] DNA 절단 효소를 찾기 위한 노력

현재 유전체 편집을 위해 실험실에서 가장 많이 사용되는 크리스퍼 유전자 가위는 CRISPR-Cas9이라는 시스템이다. 본 연재를 비롯하여 최근까지 크리스퍼를 이용한 유전체 교정이나 편집에 관한 글도 대부분 가장 간단하고 많이 사용되는 CRISPR-Cas 9에 대한 내용이었다. CRISPR는 수많은 세균이 가지고 있는 유전체 내에 일정한 회문 구조를 만들 수 있는 DNA 염기 서열이 반복되는 부분을 일컫는다. 처음에 이 반복되는 염기서열 사이에 바이러스 DNA 정보에 해당하는 염기서열이 들어 있다는 것이 발견되어, 후에 CRISPR가 세균의 면역체계라는 것을 밝힐 수 있었다. 그리고 반복 사이의 염기서열에 해당하는 DNA를 인식해 자르는 DNA절단 효소가 Cas9이다. Cas9는 포도상구균이라는 세균의 CRISPR 시스템이 가지고 있던 DNA절단 효소 유전자이다. 세균의 CRISPR 유전자를 가져다 그 반복 서열 사이에 바이러스 염기서열 대신 우리가 자르고 싶은 임의로 일정 DNA 염기서열을 넣어주고 Cas9 유전자와 함께 발현시켜주면, 유전체 내에서 넣어준 서열과 일치하는 부분으로 찾아가 Cas9이 자른다.

이렇게 이야기하면 아주 단순해 보인다. 그러나 실제 세포에서 일어나는 상황은 이보다 훨씬 예민하고 복잡하다.
DNA는 두 가닥의 실이 꼬인 이중나선이다. Cas9이 자르는 방법은 두 가닥을 그야말로 싹둑 자르는 것이다. DNA의 한 줄은 더 길고 다른 한 줄은 더 짧게, 어슷하게 자르는 것이 아니다. DNA를 자르는 것이 목적이라면 싹둑 자르면 어떻고 또 어슷하게 자르면 어떠할까? 어차피 DNA를 자르면 되는 것이 아닐까? 그러나 세포에서의 상황은 어떻게 자르느냐에 따라 잘린 유전체 DNA 부분의 운명이 달라질 수 있다.

사람의 세포이던 세균의 세포이던 사실 세포의 입장에서 보면 유전체 DNA의 중간이 잘린다는 것은 엄청난 위협이다. 세포의 생존이 달린 문제다. 그래서 세포는 DNA가 절단되어 손상되면 이를 복구하는 시스템을 가지고 있다.

가장 단순하게 끊어진 DNA를 복구하는 방법은 가까이 있는 다른 싹둑 잘린 DNA 부분을 가져다 붙이는 것이다. 이 방법은 일단은 끊어진 DNA 부분을 복구할 수는 있으나 아무 다른 DNA의 끝부분을 가져다 붙이는 것이므로 변이가 초래될 가능성이 매우 높다. 더 정교한 손상된 DNA를 복구하는 방법은 세포에 존재하는 절단된 부분과 염기서열이 유사한 다른 부분을 찾아 유사한 부분의 DNA이중나선을 벌리고 그 염기서열 정보를 이용해 절단된 부분을 복구하는 것이다. 이 방법은 변이가 일어날 확률이 더 낮고 정확하게 복구될 가능성이 더 높다. 현재 우리는 세포가 어떻게 이 두 가지 복구 방법 중 한 가지 방법을 선택하는 결정을 내리는지 그 과정을 잘 알지 못한다. 그냥 무작위적으로 결정되는 것 같기도 한데 첫 번째 방법이 두 번째 정교한 방법보다는 더 쉽게 자주 일어난다. 또 DNA의 이중 나선이 싹둑 잘린 경우는 첫 번째 방법이 더 자주 선택되고 어슷하게 잘려 한 줄이 다른 한 줄보다 몇 염기가 더 길게 붙어있는 경우에는 두 번째 정교한 복구방법이 선택될 가능성이 더 높아진다고 알려져 있다. 또 DNA 이중나선을 어슷하게 자를 수 있으면 어슷하게 잘린 한쪽 줄이 더 길게 끝이 너덜너덜한 부분은 그 부분의 염기서열 짝이 맞는 다른 어슷한 끝을 갖는 DNA 조각과만 접합이 되고 또 쉽게 붙게 되므로 기존 유전체 내의 유전자를 잘라내고 외부에서 넣어준 다른 유전자와 교체하려고 할 때 효율적으로 작동할 수 있다. 그러므로 CRISPR 시스템을 적용해 유전체를 절단하는 목적이 그냥 유전체에 존재하는 유전체를 없애버리던가 변이를 유발하려는 목적이면 CRISPR-Cas9 시스템의 효용이 높을 수 있다. 그러나 유전체 정보 중 잘못된 부분을 잘라내고 정상적인 유전자로 교체하려는 경우에는 효율이 많이 떨어질 수 있는 단점이 있다.

Cas9를 사용할 때의 또 다른 한계는 자르고자 하는 유전체의 DNA 표적 위치에 염기 '구아닌(G)'이 두어 개 있어야 한다는 제한 조건이다. 그렇기에 표적 DNA 염기서열 위치에 구아닌 두 개가 연속으로 없는 경우는 사용할 수 없다는 것이다.

이러한 Cas9의 제한 조건을 타개하기 위해 다양한 세균의 CRISPR 시스템을 조사하여 Cas9 이외의 다양한 CRISPR DNA 절단 효소를 찾는 노력이 계속 되었고 이렇게 찾아진 것이 Cpf1이라는 또다른 CRISPR DNA 절단 효소다. Cpf1은 MIT의 펑 장 (Feng Zhang) 박사 연구실에서 처음 보고하였고 Prevotella와 Francisella 라는 이름의 세균에서 발견되어 CRISPR와 각각 세균의 첫 자를 따라 Cpf1이라고 명명되었다. 무엇보다 Cpf1은 DNA를 싹둑 자르는 Cas9과는 달리 DNA를 어슷하게 자를 수 있어 세포 내에서 정교한 복구과정을 유도하고 잘못된 부분을 잘라내고 정상적인 유전자로 교체하려는 경우 그 효율을 높일 수 있을 것으로 기대되고 있다. 또 Cpf1 단백질은 Cas9과는 달리 유전체의 DNA 표적 위치에 ‘티민(T)’이 여럿 있는 경우 작동한다고 알려졌다. 따라서 표적 DNA 염기서열에 구아닌이 연속으로 2개 이상 존재하지 않을 경우 Cas9은 사용할 수 없지만 대신 다수의 티민이 있을 경우 Cpf1을 사용할 수 있으므로 유전체에 유전자가위를 적용할 때 선택지를 새로 만들어 주었다.

사실 지구에는 수천만 종의 다양한 세균종이 존재하고 이들 중 1/3 정도가 CRISPR 시스템을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 보통 온도와 압력, 염분 농도 등이 극히 높은 극한 환경에서 서식하면서 생명의 신비를 보여주는 Archaea라고 불리는 고세균류는 90% 이상 CRISPR 시스템을 갖고 있는 것으로 보고되었다. 또한 세균과 고세균에 현재까지 크게 나누어 6가지 다른 타입의 CRISPR 시스템이 존재하고, 이들을 특색에 따라 세분하면 적어도 19가지 정도의 서브타입이 존재한다고 보고되고 있다. 따라서 앞으로 다양한 세균 종의 여러 시스템 내에 있는 다른 특이성을 갖는 여러 가지 CRISPR DNA 절단 효소들을 찾을 수 있는 가능성이 높다. 미래에는 Cpf1 이외에도 다양한 유전체 편집용 DNA 절단효소들이 추가되어 유전체 변형의 용도에 따라 특이성이나 효율을 더 높일 것으로 기대할 수 있을 것이다.